Москва 7-961-338-18-88 Наша страница Вконтакте

X052 

Сферы применения иммобилизованных ферментов.

 

В настоящее время известны реакции ферментативного превращения практически всех основных классов органических соединений. Особенно успешно биокаталитические приемы применяются в таких процессах, как получение оптически активных аминокислот и других органических кислот; модификация антибиотиков, стероидов, алкалоидов; синтез пептидов, простагландинов, олиго- и полинуклеотидов, нуклеозидтрифосфатов; введение радиоактивной метки в белки, пептиды, аминокислоты и нуклеиновые кислоты; получение фосфолипидов и переработка растительного липидного сырья; специфическое расщепление биополимеров и т.д.

 

I. Применение иммобилизованных ферментов в медицине.

Иммобилизованные ферменты – основа одного из главных направлений современной биотехнологии. Сегодня с их помощью уже производятся в больших количествах многие важные продукты. В первую очередь это разнообразные биологически активные вещества. Например, в медицине широко используются индивидуальные аминокислоты; но при их химическом синтезе получается смесь природной и неприродной – левой и правой форм аминокислоты, а организм может усваивать только природную, левую форму. Разделить такие смеси проще всего с помощью ферментов.

Широко используется в медицине способность ферментов реагировать на строго определенные вещества – на этом основаны новые, высокочувствительные методы анализа, применяемые, в частности, в диагностике. Например, если человек болен, то его иммунная система вырабатывает определенные антитела – с помощью ферментов можно их определить; обнаруживать и самих возбудителей заболевания.

Ферменты значительно упрощают анализ крови: если сегодня для биохимического анализа нужно взять целую пробирку крови, то созданный в самые последние годы иммуноферментный метод позволяет ограничиваться всего одной каплей, чтобы определить содержание около 50 веществ одновременно.

Иммобилизованные ферменты находят применение и непосредственно как лекарственные препараты. Группа ученых под руководством академика Чазова Е.И. создали иммобилизованный ферментный препарат стрептодеказу для растворения тромбов при лечении инфаркта миокарда. После введения данного препарата тромб, если его захватить вовремя, почти бесследно исчезает. Это очень важное и серьезное достижение ферментной технологии.

 

1. Использование иммобилизованных ферментов при производстве полусинтетических β-лактамных  антибиотиков.

Очень большое влияние оказало на развитие медицины открытие пенициллина. Природный пенициллин вырабатывается некоторыми видами зеленой плесени (Реniсillium). Все эти соединения – производные 6 – АПК (6-аминопеницилла новая кислота), а именно амиды, образованные различными кислотами RCOOH и аминогруппой 6-АПК. Сама 6-АПК обладает лишь незначительной антибиотической активность.

Важный элемент строения 6-АПК – наличие β-лактамного цикла, характерного и для других антибиотиков, например цефалоспоринов.

Из-за этого структурного элемента рассматриваемые соединения относят к классу β-лактамных антибиотиков. Изменение группы R приводит к заметным изменениям свойств пенициллинов, в частности их биологической активности.

Оказалось, что при введении в среду, на которой растет Penicillium chrysogenum, карбоновых кислот или их производных преимущественно образуется тот пенициллин, который содержит боковую цепь введенной кислоты. Полученные таким способом пенициллины называют биосинтетическими. Метод достаточно эффективен. В присутствии фенилуксусной кислоты и пара-оксифенилуксусной кислоты (кислот с высокими выходами) получают бензил- и п-оксибензилпенициллины соответственно, а в присутствии феноксиуксусной кислоты – феноксипенициллин, который обладает ценным свойством: он устойчивее к расщеплению под действием кислот, и поэтому его можно принимать внутрь в виде таблеток.

Однако многие перспективные пенициллины получить биосинтетическим путем не удается из-за того, что вводимые предшественники вовлекаются в неконтролируемые побочные процессы. Выход был найден, когда биохимики предложили получать полусинтетические пенициллины. 6-АПК вступает в реакцию ацетилирования хлорангидридами карбоновых кислот, и дает при этом любые требуемые аналоги пенициллина.

Химический синтез 6-АПК слишком трудоемок для промышленного использования. Достаточно дешевый источник 6-АПК - биосинтетический бензилпенициллин, гидролиз которого давал бы 6-АПК. Однако химический гидролиз бензилпенициллина идет не по амидной связи с 6-аминогруппой, а по более лабильной амидной связи напряженного β-лактамного кольца. Здесь на помощь приходит уникальная специфичность ферментного катализа: под действием фермента пенициллинамидазы идет расщепление только требуемой связи и не затрагивается β-лактамное кольцо.

Были изучены кинетика и механизм действия пенициллинамидазы, способы ее иммобилизации и стабилизации. Этот фермент легко включается в полиакриламидный гель, модифицированный глутаровым альдегидом, и обладает в нем достаточно высокой стабильностью.

Процесс с использованием иммобилизованной пенициллинамидазы внедрен в производство в последние годы. Это открыло доступ к широкомасштабному производству многих полусинтетических пенициллинов, обладающих высокой устойчивостью в кислых средах, высокой активностью по отношению к большому количеству микробов, низкой токсичностью для организма человека, устойчивостью к ферменту β-лактамазе, гидролизующему в отличие от пенициллинамидазы расщепление лактамного кольца, что приводит к полной потере антибиотической активности. Первое крупнотоннажное производство в СССР, основанное на применении иммобилизованных ферментов, вступило в строй в 1976 г. на Саранском заводе медицинских препаратов: здесь с помощью с помощью пенициллинамидазы был налажен выпуск 6 – аминопенициллановой кислоты, необходимой для синтеза ряда антибиотиков пенициллинового ряда. В создании этой технологии принимали участие сотрудники ВНИИантибиотиков, Таллиннского политехнического института, МГУ, а также специалисты Рижского и Саранского заводов медпрепаратов.

Пенициллинамидазе присуща уникальная специфичность и по отношению к гидролизу цефалоспоринов: отщепляется только боковая группа, а β-лактамный цикл остается не тронутым. Это использовано для создания второго технологического процесса – получения 7-АДЦК (7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты) гидролизом соответствующего фенилацетатного производного. Таким образом, открывается путь к получению очень перспективных лекарственных средств на основе «полусинтетических» цефалоспоринов.

Пенициллинамидаза, как и любой химический катализатор, не смещает равновесия, а только увеличивает скорость его достижения. Фермент катализирует как прямую реакцию – гидролиз, так и обратную – синтез антибиотика. Это обстоятельство и используется ферментативного синтеза.

Водный раствор, содержащий 6-АПК или 7-АДЦК, а также соответствующую кислоту, приводят в контакт с иммобилизованной пенициллинамидазой. Через некоторое время в растворе образуется равновесное количество антибиотика. Преимущество метода в его простоте; например, можно использовать непосредственно кислоту, а не ее хлорангидрид. Основной недостаток – низкая скорость реакции для большинства R. Причина этого кроется в его высокой специфичности.

 

2. Разделение рацематов аминокислот.

Аминокислоты используют в медицине, сельском хозяйстве, прикладной микробиологии и во многих отраслях науки. Они необходимы как компонент питания при недостаточности какой-либо из природных аминокислот, как составная часть внутреннего питания больных людей, для создания лекарственных и биохимических соединений и т.д. Все аминокислоты усваиваются только в L-форме, а попадание в организм D-формы крайне не желательно.

L- и D-формы – это энантиомеры, разновидность изомеров, являющихся зеркальными отражениями друг друга. Смесь L- и D-форм в равных количествах называют рацемической. Ей присущи все свойства чистого вещества, ибо L- и D-изомеры во всех отношениях идентичны, кроме тех случаев, когда они вступают во взаимодействие с другим асимметрическим объектом.

Химический синтез всех аминокислот – давно решенная задача. Однако химические методы дают всегда рацемическую смесь аминокислот, и, следовательно, необходима дополнительная стадия разделения энантиомеров. Чисто химически это сделать очень трудно. В то же время ферменты способны «узнавать», а значит и по-разному реагировать на L- и D-формы аминокислот или их производные. Преимущественное расщепление одного из энантиомеров под действием ферментов настолько предпочтительно, что, как правило, они быстро реагируют с L-изомером, совершенно не затрагивая D-изомер. Это обстоятельство, т.е. энантиоселективность, и было положено в основу ферментативного разделения рацемических смесей аминокислот.

Вероятно, первым реактором, где использовали иммобилизованный фермент в промышленном масштабе, был именно реактор для разделения рацемических смесей D,L-аминокислот, он был введен в эксплуатацию в Японии (1969 г.) на аминоацилазе, иммобилизованной на сефадексе.

С 1969 г. таким путем осуществляется промышленное производство незаменимых аминокислот: L–метионина, L–фенилаланина, L–валина, L–аланина.

Промышленный процесс выглядит следующим образом. Исходными веществами служат модифицированные по аминогруппе D,L-аминокислоты, полученные в результате химического синтеза. На эту смесь воздействуют иммобилизованной аминоацилазой. Фермент гидролизует амидную связь только у L-изомера. В результате образуется свободная L-аминокислота, обладающая более высокой растворимостью, чем ацильное производное. Образовавшаяся смесь свободной L-аминокислоты и ацилированной D-аминокислоты разделяют простыми физическими методами, пользуясь их различной растворимостью. Оставшийся после разделения D-изомер обычно при повышенной температуре рацемизируют, т.е. превращают в исходную D,L-смесь и снова пускают в реакцию с ацилазой. В итоге добиваются высокой концентрации L-аминокислоты. Фермент аминоацилаза мало чувствителен к типу аминокислоты, и поэтому одна установка с иммобилизованным ферментом может использоваться для получения разнообразных  L-аминокислот.

Иммобилизацию аминоацилазы проводят адсорбцией на специально подобранном полимерном носителе. Когда ее активность падает, в реактор добавляют, свежую порцию фермента, которая тут же адсорбируется на носителе.

 

3. Иммобилизованные ферменты и лечебное питание.

Иммобилизованные ферменты успешно используются также и в химических процессах пищевой промышленности, в частности для получения глюкозы из крахмала, для получения глюкозо-фруктозного сиропа, для улучшения качества молока путем удаления из него лактозы и т.п.

Благодаря ферментным методам начинает стираться грань между привычными пищевыми технологиями и промышленностью тонкого органического синтеза. Так, фирма «Cetus Corporation» в США разработала процесс, в результате которого образуется фруктоза (пищевой продукт) и окиси алкенов (полупродукт органического синтеза). Для этого глюкозу, полученную из крахмала, окисляют в присутствии иммобилизованного фермента, пиранозо-2-оксидазы до глюкозона, который затем с помощью водорода на палладиевом катализаторе превращают во фруктозу. На первой стадии в качестве побочного продукта образуется перекись водорода, используемая далее для микробиологического окисления этилена или пропилена в соответствующие эпоксиды. Таким образом, в данном технологическом цикле тесно переплетены между собой 3 синтетических метода: ферментативный (первая стадия), химический (вторая стадия) и микробиологический (третья стадия). Именно сочетание разных методов обеспечивает высокую экономичность производства.

3.1 Удаление лактозы из молока с помощью иммобилизованных ферментов.

Малосладкий дисахарид – лактоза, присутствующий в молоке, легко усваивается детьми, особенно в младенческом возрасте, а вот у взрослых людей иногда наблюдается интолерантность к молоку, что обусловлено отсутствием лактазы в тонком кишечнике. Молочный сахар (лактоза) не расщепляется до глюкозы и галактозы. После потребления молока такие люди страдают расстройствами желудка, вздутием и болями в нижней части живота. До сих пор нет ясности, является ли отсутствие лактазы наследственным. Такое заболевание особенно широко распространено в развивающихся странах, а ведь именно население этих стран особенно нуждается в таком дешевом и одновременно полноценном продукте питания, как молоко. Чтобы у людей с подобными отклонениями молоко усваивалось, оно было ферментативно обработано с помощью иммобилизованной лактазы.

Итак, проблема была решена, когда молоко стали предварительно обрабатывать иммобилизованной лактазой. Такое лактозное молоко уже получают по соответствующему биотехнологическому процессу.

В Италии с 1975 г. работает завод по переработке молока с помощью иммобилизованной лактазы в диетическое безлактозное молоко. Ежедневно предприятие выпускает 800 л данного диетического продукта.

Более того, разрабатывают ферментативный гидролиз лактозы как дополнительный путь получения глюкозы. Дело в том, что при свертывании молока до 75% лактозы остается в сыворотке, которую пропускают через колонну с иммобилизованной лактазой и получают после дополнительной очистки водный раствор смеси глюкозы и галактозы, которую непосредственно можно использовать в пищевой промышленности.

3.2 Превращение глюкозы во фруктозу с помощью иммобилизованной глюкоизомеразы.

Фруктоза слаще глюкозы почти в 2 раза. Фруктоза – это изомер глюкозы. Она имеет ту же самую химическую формулу. Использование фруктозы вместо сахара сулит массу преимуществ. Из-за большей сладости ее можно применять в меньших количествах, что ведет к снижению калорийности продуктов, а это важно для диетологии. Фруктозу в отличие от глюкозы и сахарозы могут потреблять больные диабетом. Дело в том, что пути превращения фруктозы человеческом организме совершенно иные, нежели глюкоза, и не связаны с наличием инсулина. К тому же фруктоза менее вредна для зубов.

Не смотря на все эти положительные факторы, фруктозу до последнего времени применяли крайне ограниченно из-за отсутствия разработок ее промышленного производства. Для того чтобы увеличить сладость глюкозы в 2 раза, достаточно было бы ее просто химически превратить во фруктозу, но все попытки осуществить изомеризацию глюкозы во фруктозу химическим путем с помощью промышленных катализаторов окончились неудачей, поскольку при этом неспецифически образовывались темно окрашенные побочные продукты с плохим вкусом. Очистка фруктозы от них была бы слишком дорогой.

Положение изменилось в 70-х гг., когда в производстве стали применять фермент глюкоизомеразу, который катализирует взаимопревращения глюкозы во фруктозу.

В 1957 г. была открыта глюкоизомераза – внутриклеточный фермент, выделяемый из различных микроорганизмов.

В 1960 г. в США запатентован ферментативный процесс превращения глюкозы во фруктозу.

В 1966 г. японская исследовательская лаборатория фирмы «Шиба сити» описала промышленный процесс с использованием растворимой глюкоизомеразы. При промышленной изомеризации глюкозы в качестве конечного продукта получают не одну фруктозу, а смесь глюкозы и фруктозы (сироп), обладающей высокой сахаристостью.

В 1967 г. американская фирма «Клинтон крон процессинг компани» приступила к производству глюкозо-фруктозного сиропа из глюкозы с помощью растворимой глюкоизомеразы. Но сироп содержал всего 15 % фруктозы. Кроме того, выяснилось, что процесс с участием глюкоизомеразы может быть рентабельным только при многократном использовании дорогостоящего фермента. Глюкоизомераза оказалась идеальным ферментом для иммобилизации: стабильная при высоких температурах, а т.к. субстрат (глюкоза) и продукт реакции (фруктоза) – очень небольшие молекулы, то не возникает проблем с их движением по колонке с иммобилизованным ферментом. Ни глюкоза, ни фруктоза не несут электростатического заряда, поэтому глюкоизомеразу можно было адсорбировать на заряженных группировках целлюлозы.

В 1968 г. концерн «Клинтон» предложил периодический метод превращения глюкозы во фруктозу с помощью иммобилизованного фермента, при котором выход фруктозы составлял 42 %.

В 1978 г. начался новый этап в развитии этого производства. Благодаря применению новых способов разделения удалось получить 55 % фруктозного сиропа.

Технология превращения глюкозы во фруктозу:

В колонку высотой до 5 м загружают иммобилизованный фермент, например, в виде гранул и затем непрерывным потоком пускают водный раствор глюкозы. На выходе получают так называемый глюкозо-фруктозный сироп – довольно концентрированный водный раствор примерно равных количеств глюкозы и фруктозы. Этот сироп можно использовать непосредственно или, отделив фруктозу, а оставшуюся глюкозу вновь подвергнуть изомеризации до смеси фруктозы и глюкозы, и т.д.

 

4. Ферментные электроды на основе иммобилизованных ферментов.

Иммобилизованные ферменты нашли применение и для аналитических целей в виде ферментных электродов (датчиков или биосенсоров). В любом ферментном электроде обязательно есть собственно электрод, слой иммобилизованного тем или иным способом фермента и, зачастую, диализная полупроницаемая мембрана, предотвращающая диффузию фермента в раствор, но пропускающая низкомолекулярные соединения к поверхности электрода. Достаточно внести электрод в раствор, содержащий специфическое по отношению к ферментному электроду вещество (субстрат), и в приэлектродном слое происходит ферментативная реакция, ее продукты определяют с помощью того или иного электрохимического устройства. Присутствие на электроде фермента-биокатализатора с высокой специфичностью действия – позволяет определять наличие и концентрацию в сложной по составу смеси подчас одного – единственного вещества. В настоящее время с помощью биосенсора можно определить 10 соединений: глюкозу, лактат, этанол, лактозу, галактозу, сахарозу, α-амилазу, α-лизин, мочевую кислоту, холин.

Иммобилизованные ферменты применяются в автоматическом анализе биологических субстратов и лекарственных веществ. Они являются рабочей частью автоматических проточных анализаторов. Ферментные электроды позволяют проводить непрерывный анализ веществ. На основе проточных анализаторов с иммобилизованными ферментами и ферментных электродов созданы биохимические автоматы, позволяющие в короткие отрезки времени проводить обследование больших контингентов людей. Иммобилизованные ферменты (ферментные электроды) применяют для непрерывного контроля загрязненности окружающей среды токсическими веществами.

В будущем иммобилизованные ферменты найдут значительно более широкое применение, в составе ферментсодержащих электродов, используемых для мониторинга in vitro и in vivo. Много подобных систем уже сконструировано, но в клинике пока не применяется.

Был разработан электрод с глюкозооксидазой. В устройстве Апдайка и Хикса глюкозооксидаза нанесена на поверхность обычного платинового электрода. Чем больше кислорода потребляется в реакции:

Глюкоза+Кислород=Глюконовая кислота + Перекись водорода,

тем меньше количество его регистрируется внутренней частью электрода. Недостаток устройства – ненадежность, что не позволяет использовать его как имплантируемый аппарат для постоянной регистрации содержания глюкозы. Эти проблемы связаны с наличием конкурентных отношений между глюкозой и кислородом в жидкостях тела, инактивацией фермента in vivo, сложностью калибровки и дрейфом характеристик электрода.

Ведущиеся исследования позволяют надеяться, что, усовершенствовав такие электроды с ферментами, удастся со временем создать датчик глюкозы для автономно работающего, полностью автоматического и небольшого по размеру протеза поджелудочной железы, нужного для лечения больных диабетом. В этой связи особенно важны последние достижения в области разработки ферментсодержащих электродов. Исследователи, работающие в Крэнфилдском технологическом институте Оксфордского университета и в госпитале Гая в Лондоне, разрабатывают глюкозный электрод, в котором для переноса электронов от простетической группы глюкозооксидазы на графитовый электрод используется органический медиатор (например, ферроцен), т.е. процесс идет без участия кислорода, который обычно выступает в роли конечного акцептора электронов. Работа этого электрода, таким образом, не связана с кислородом и поэтому он может оказаться полезным при создании имплантируемого, способного работать in vivo устройства для больных диабетом.

По-видимому, основные усилия в ближайшие несколько лет будут направлены на развитие технологии биодатчиков. Ферменты могут оказаться весьма полезными для контроля за концентрацией разнообразных веществ, интересующих клиницистов промежуточных метаболитов, лекарственных препаратов и гормонов.

Применение перевязочных средств с иммобилизованными ферментами и антибиотиками.

Для лечения гнойных ран предложено множество различных способов и схем, но до сих пор эта задача остается сложной и не до конца решенной. Большое количество больных с острыми воспалительными заболеваниями, гнойными послеоперационными осложнениями, а также преобладание в ране микрофлоры, малочувствительной или нечувствительной к антибиотикам, заставляют искать новые способы терапии.

Активное хирургическое лечение гнойных ран не исключает традиционного лечения под повязкой, весьма распространенного в клинической практике. Однако ватно-марлевые перевязочные средства нередко оказываются  индифферентными к раневому процессу, а порой и ухудшает его лечение. Ворсистость, высокая степень адгезии к ране, отсутствие дренирующих свойств при сорбции гнойного отделяемого и ряд других параметров не создают благоприятных условий для заживления ран.

Среди множества методов местного лечения гнойных ран одним из наиболее признанных является сорбционно-аппликационная терапия, основанная на очищении инфицированных ран за счет физической сорбции.

С накоплением опыта стали очевидными преимущества сорбционно-аппликационного метода: эффективность, доступность, простота, относительная экономичность, возможность влиять на течение раневого процесса дифференциацией сорбентов, отсутствие аллергических и других побочных явлений, что стимулировало развитие исследований в области создания новых видов сорбционных материалов.

Перевязочные средства на основе биологически активных полимерных материалов ознаменовало новую эру в лечении ран. Они позволяют вводить лекарственные средства непосредственно в гнойную рану, а главное - создавать терапевтически эффективную и постоянную их концентрацию в очаге гнойной инфекции.

Перспективным направлением является иммобилизация лекарств на матрице, обеспечивающей пролонгированную подачу препарата при однократном местном применении. Рассмотрим некоторые примеры.

По мнению И.М. Самодумовой и соавт. (1988 г.), полиметилсилоксан (ПМС) по структурно-сорбционным свойствам имеет преимущества перед другими сорбентами и пригоден в качестве  матрицы, т.к. обладает высоким сродством к веществам органической природы, и при иммобилизации на нем некоторые вещества проявляют гидрофильные свойства, что активизирует местную детоксикацию пораженных тканей. Недостаток ПМС состоит в том, что при аппликации на рану происходит его высушивание, исчезает влажная микросреда, необходимая для регенераторных процессов. Местное применение иммобилизованных на ПМС антибиотиков, ферментов, анестетиков позволило сократить продолжительность лечения и пребывание в стационаре, как минимум, на 40 – 50 %. Поверхность ожога или трофической язвы становилась пригодной к пластике в 2 раза быстрее, чем при лечении обычными методами, приживаемость лоскутов кожи составила 90 – 98 %. На 2 – 3-и сутки от начала лечения отмечены также резкое уменьшение отечности окружающих тканей, количества раневого отделяемого, длительное и стойкое снижение интенсивности болевого синдрома.

С целью подавления имеющейся в ране микрофлоры, предупреждения вторичного инфицирования, борьбы с ожоговым шоком и общей интоксикации на всех этапах медицинской эвакуации предложен углеродминеральный сорбент СУМС – 1, поглощающий грамположительную и грамотрицательную микрофлору, высоко- и среднемолекулярные токсины, продукты распада микробов и тканей. Адсорбированные на нем фурагин, йодпирин и диоксидин воздействуют на большинство известных микроорганизмов в течение 2 – 3 суток, что важно при транспортировке пострадавших. Аппликационно-сорбционные способы лечения с гнойными ранами мягких тканей и ожогами позволяют в 2 – 4 раза быстрее снизить количество микробов в 1 г тканей и в 3 – 4 раза сократить процент присоединения вторичной инфекции.

Исследованиями А.Г. Саркисяна и соавт. установлено, что шарики полиметилметакрилата «Септопал», применяемые при лечении гнойных осложнений у травматических и ортопедических больных, высвобождают входящий в его состав гентамицин в таком количестве, которое требуется  для подавления местного антибактериального действия.

В числе биологически активных гидрофильных сорбентов следует отметить лизосорб, созданный на основе сшитого поливинилового спирта с иммобилизованным на нем террилитином и антибиотиками неомицином и полимиксином. Ряд публикаций свидетельствуют о высоком лечебном эффекте этого сорбента при лечении гнойно-некротических ран (послеоперационных нагноений, трофических язв и ожогов).

Накопленные материалы свидетельствуют о перспективности использования многочисленных вариантов местной сорбционной терапии для лечения гнойных ран различного генеза и локализации.

 

II. Применение иммобилизованных ферментов в органическом синтезе.

В настоящее время большое количество зарубежных фирм занимается созданием нового направления биотехнологии, основанной на катализе с применением иммобилизованных ферментов. Среди реализованных процессов можно указать на получение L-яблочной кислоты гидратацией фумаровой кислоты с помощью фермента фумаразы и получение L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония под действием фермента аспарагиназы. В последнем случае в реакторе объемом 1 м3 ежедневно получают 1700 кг продукта.

Близок к промышленному воплощению синтез еще одной ценной кислоты, L-триптофана, из индола и пирувата аммония.

Таким образом, ферменты могут использоваться для реализации промышленных процессов получения различных химических продуктов, которые сейчас синтезируют сложными и дорогими химическими способами. Например, синтез окиси пропилена, представляющей собой маленькую молекулу, состоящую из углерода и водорода, в которую определенным образом введен атом кислорода. Данное химически активное соединение широко используется для синтеза эпоксидных смол. Окись пропилена получают сложным химическим путем, который обходится очень дорого, следовательно, это обстоятельство обуславливает и высокую стоимость эпоксидных смол. Но недавно обозначился новый путь получения окиси пропилена – ферментативный, отличающийся высокой эффективностью и дешевизной.

 

III. Применение иммобилизованных ферментов в химии полимеров.

Очень важным является налаживание сотрудничества представителей разных специальностей: биотехнологов, биохимиков, а также представителей полимерной химии, т.к. многие применяемые сейчас носители для иммобилизации ферментов были найдены случайно, и не всегда это самые лучшие носители. Необходимо научиться подбирать оптимальные носители для определенной цели, для определенного фермента, создавать такие носители, которые будут служить не просто опорой для фермента, но и могли бы выполнять за него часть его работы, например, концентрировать субстрат в непосредственной близости от его активного центра.

 

IV. Особенности переработки целлюлозы с помощью иммобилизованных ферментов.

Больше половины углерода, накапливаемого тканями растений в ходе фотосинтеза, отлагается в них в виде целлюлозы и лигноцеллюлозы. Непосредственно использовать их организмы высших животных и человека не могут, но в природе существуют весьма эффективные ферментные системы, позволяющие мобилизовать этот углерод в виде доступных организму соединений – сахаров. Для человечества было бы очень важно использовать такие процессы, чтобы изменить направление фиксации углерода в растительных тканях. Проблема эта непростая: целлюлоза и лигноцеллюлоза – субстраты очень сложные, и хотя о ферментах, участвующих в их гидролизе, известно довольно много, но еще недостаточно, чтобы можно было управлять этим процессом или создавать новые, более эффективные ферменты. В этой области нужно приложить еще много усилий, но успешное решение проблемы даст нам новый богатый источник получения веществ.

 

«Ферментные комбинаты».

Очень перспективная область ферментной технологии – создание ферментных систем, когда на одном и том же носителе, в непосредственной близости друг от друга, иммобилизуется два или большее количество ферментов, работающих последовательно. При этом можно добиться того, чтобы активные центры ферментов были определенным образом ориентированы относительно друг друга. Таким путем удается значительно повысить эффективность их работы: образующиеся под действием одного фермента промежуточные продукты в такой системе сразу же поступают на другой фермент, что особенно важно, когда промежуточные продукты неустойчивы и легко разрушаются в окружающей среде: в такой системе они не выходят наружу, а сразу же перерабатываются.

Усовершенствование методов иммобилизации ферментов позволяет намного увеличить их стабильность. Например, если прикрепить фермент к носителю не в одной точке, а во многих, у него заметно повышается термоустойчивость: так, если обычно фермент не выдерживает увеличение температуры более чем до 65 – 66 °С, то теперь он может работать при 80 °С и более. Таким путем можно сделать ферменты более устойчивыми и к высокому содержанию в среде солей или органических растворителей – последнее особенно важно для увеличения эффективности синтеза пептидов.

Для работы некоторых ферментов нужны коферменты – небелковые соединения, присутствие которых является обязательным условием активности фермента. Эти вещества имеют сложное строение и получение их дорогостоящий процесс, а добавлять их в реакционную среду приходится в большом избытке. В последнее время разрабатываются методы, позволяющие прикреплять молекулу кофермента непосредственно к молекуле фермента. Больше того, кофермент можно «посадить» на гибкой «ножке» - небольшой линейной молекуле – рядом с активным центром фермента: «ножка» изгибается, кофермент приближается к активному центру, срабатывает там, а потом «ножка» разгибается, кофермент окисляется в среде или на электроде и снова готов к работе. В данном случае кофермента требуется гораздо меньшее количество, т.к. он используется намного эффективнее; к тому же такая система гораздо устойчивее к ингибиторам реакции, поскольку кофактор «сидит» в непосредственной близости от активного центра фермента.

 

Иммобилизация целых клеток микроорганизмов и растений.

Непревзойденным «мастером» иммобилизации является живая клетка. Ферменты, связанные в клетке естественным путем, без труда превосходят все искусственно иммобилизованные ферменты по активности и стабильности. Последовательное «включение» ферментных реакций в мультиферментных системах или регенерация коферментов не представляет для клетки никаких трудностей. При этом каждый фермент имеет в клетке оптимальную микросреду. Лишь после иммобилизации ферментов биотехнологам пришла в голову мысль сходными методами иммобилизовывать целые микроорганизмы, а также животные и растительные клетки. Поэтому нет принципиальных различий между иммобилизацией ферментов и клеток. Иммобилизуются как живые, так и мертвые клетки микроорганизмов, но в последнем случае ферменты должны быть еще активными.

Особые успехи в области иммобилизации клеток достигнуты в Японии. Профессору Сибате принадлежат пионерские работы не только по иммобилизации ферментов, но и по фиксированию на носителях целых клеток. Например, его группой разработан процесс синтеза аспарагиновой кислоты из фумаровой с помощью иммобилизованных в геле клеток Е.соli. Таким образом, ежегодно получают 600 т. аспарагиновой кислоты. Лишь через 120 суток активность аспартазы бактерий уменьшается вдвое.

Сходный процесс с иммобилизованными клетками Brevibacterium позволяет получить L- яблочную кислоту из фумаровой; таким путем ежегодно производится 180 т. яблочной кислоты.

В этих случаях используется один-единственный бактериальный фермент (аспартаза и фумараза).

Естественно, еще более пригодны иммобилизованные микроорганизмы для многоступенчатых процессов, например, широкие возможности открываются при производстве спирта с помощью иммобилизованных дрожжей. Этанол образуется из глюкозы в анаэробных условиях в результате многоступенчатой реакции, в которой используются системы регенерации АТФ и НАДФ. Японская компания «Киова Хакко» длительное время на опытных заводских установках с иммобилизованными клетками дрожжей получает 2400 л. спирта в день из тростниково-сахарной массы. Производительность такого полностью автоматизированного процесса в 20 раз выше по сравнению с традиционными реакторами периодического действия, причем затраты на электроэнергию и рабочую силу существенно ниже.

Возможности иммобилизованных клеток велики. Их можно использовать практически во всех известных сегодня биотехнологических процессах. По сравнению со свободноживущими клетками иммобилизованные клетки обладают преимуществами, например, при производстве аспарагиновой кислоты из фумаровой с помощью иммобилизованных клеток издержки производства снизились на 40%, благодаря повышению производительности труда, экономии фондов заработной платы, автоматизации и повышению выхода продукта.

Преимущества иммобилизованных клеток заключаются, прежде всего, в том, что отпадает необходимость в очистке ферментов, причем активность и стабильность иммобилизованных клеток очень высоки, с их участием легко осуществляются многоступенчатые процессы, при которых требуется регенерация коферментов, но с участием иммобилизованных клеток не удается расщепить высокомолекулярные субстраты (например, крахмал), т.к. они не могут преодолеть такого барьера, как клеточная мембрана. В этом случае можно было бы одновременно использовать клетки и внеклеточные ферменты.

Для аналитических целей можно подключить иммобилизованные клетки к сенсорам, но время измерения с помощью бактериальных сенсоров значительно больше, чем в случае ферментных, вследствие длительной диффузии субстрата через мембраны клеток, кроме того, бактериальные сенсоры менее чувствительны и часто не столь специфичны, как ферментные сенсоры. Это делает ферментные сенсоры особенно удобными при определении таких сложных параметров, как, например, общее число соединений, подвергающихся биологической деградации. Для контроля состояния окружающей среды при определениях содержания кислорода в сточных водах в Японии используют микробиологический сенсор. Этот анализ занимает всего несколько минут вместо 5 дней, необходимых при традиционных определениях. Недостатком микроорганизмов является то, что в отличие от изолированных ферментов это сложные системы, причем в результате происходящего в них обмена веществ могут образовываться побочные продукты, которые должны быть в последствии удалены. Кроме того, при применении ферментов на 1 г можно иммобилизовать приблизительно в 10 раз большую активность, чем при иммобилизации клеток, т.е. при том же количестве носителя преобразовывать больше субстрата.

Таким образом, иммобилизованные клетки в ближайшем будущем не смогут заменить иммобилизованные ферменты. Скорее, обе формы иммобилизованных на носителях биокатализаторов дополняя друг друга, будут играть важную роль в промышленности завтрашнего дня.

 

Соиммобилизация.

Под соиммобилизацией понимают совместную иммобилизацию различных биокатализаторов: двух или более ферментов, видов клеток,… комбинаций ферментов и другие варианты.

Иммобилизация нескольких ферментов позволяет осуществить многостадийные процессы in vitro. Многостадийные процессы могут осуществлены также с использованием нескольких видов соиммобилизованных клеток, в частности смешанных культур микроорганизмов. Так, трансформация сорбозы в 2-кето-L гулоновую кислоту, легко переводимую в результате химического окисления в аскорбиновую кислоту, происходит при участии соиммобилизованных клеток Gluconobacter melanogenes и Pseudomonas syringia.

Большое внимание уделяют соиммобилизации ферментов и клеток. При этом возможны два варианта:

  1. Клетки имеют ту же каталитическую активность, что и совместно с ней иммобилизованный фермент. Использование такой системы позволяет значительно ускорить реакцию и стабилизировать каталитическую активность.
  2. Клетки и фермент катализируют разные реакции. В этом случае возможно поэтапное преобразование субстрата в целевой продукт. Примеры соиммобилизованных систем, включающие клетки в изолированные системы представлены в Приложении 2.

При соиимобилизации биокаталитических систем, в частности клеток с ферментами, встает проблема их функциональной совместимости. Например, попытка превратить крахмал во фруктозу с применением соиммобилизованных глюкоамилазы и бактериальных клеток с глюкоизомеразной активностью по схеме:

 

Задание 2: Выполнить лабораторную работу.

Вариант 1: Получение липосом стрептомицина сульфата методом «ручного» встряхивания и методом впрыскивания.

Ход работы:

 1. 0,2 мл 10 % раствора лецитина, 7,5 мг холестерина растворяют в 10 мл хлороформа. Раствор липидов испаряют в роторном испарителе до получения тонкой пленки. После получения пленки вносят в колбу 1,5 мл 2,5 % раствора стрептомицина сульфата в 0,01 М фосфатного буфера рН 7,5 и оставляют на 1 – 2 ч для набухания при комнатной температуре. Для образования гомогенной суспензии липосом в колбу вносят несколько стеклянных бусинок и энергично встряхивают в течение 5 мин.

2. В пробирку, содержащую 1,5 мл 2,5 % раствора стрептомицина сульфата и 3,5 мл 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,5, впрыскивают 0,35 мл 5 % раствора лецитина в этаноле, вводить его следует быстро. Игла шприца должна быть максимально погружена в водную фазу при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки.

Под микроскопом  изучают структуру липосом (мультиламиллярные или моноламиллярные), размер.

 

Электронно-микроскопический контроль размера липосом:

На сетку–подложку наносят взвесь нативных липосом. Препарат липосом на сетке контрастируют 2 % водным раствором фосфорновольфрамовой кислоты (рН 7,4).

Материал исследуют на электронном микроскопе при инструментальном увеличении 5000 – 50000. Размеры липосом измеряют на электронных микрофотографиях.

Липосомы группируют по размерам (очень мелкие, мелкие, средние, крупные и очень крупные). Средний диаметр липосом рассчитывают по формуле:

Д = [(S n Dv-3)/ (S n)]1/3*(K)-1,

где Д – средний диаметр липосом в препарате, мкм;

Dv –средний диаметр липосом в каждой группе, мкм;

n - число липосом в каждой группе;

К - коэффициент увеличения.

Липосомы нестабильны в водной фазе, поэтому их подвергают лиофильной сушке. Лиофильно высушенные липосомы вносят в лекарственные формы непосредственно перед их использованием.

 

Вариант 2: Определение оптической активности суспензии липосом в растворах калия хлорида различной концентрации.

Большая часть внутренней воды многослойных липосом осмотически активна, благодаря чему они обладают свойствами идеального осмометра, меняя свой объем в ответ на изменение концентрации наружного раствора. В гипотонических растворах вода устремляется внутрь липосом и они быстро набухают. В гипертонических растворах липосомы сморщиваются за счет потери воды из межламелярного пространства.

Колебания объема липосом в растворах можно определить фотоколориметрическими либо спектрофотометрическими измерениями. Установлено, что при набухании липосом оптическая плотность липосомальной суспензии уменьшается, а при «сжатии» липосом в гипертонических средах – возрастает.

Оптическую активность липосом оценивают измеряя тангенс угла наклона прямой зависимости оптической плотности липосомальных суспензий от концентрации раствора, в которые они помещены.

Практическая значимость исследования состоит:

  1. Разработанный метод определения осмотической активности липосом сравнительно прост в техническом отношении и особенно удобен для изучения биомембран разного липидного состава или модифицированных мембраноактивными антибиотиками.
  2. В настоящее время ведется интенсивный поиск по выяснению возможностей медицинского применения липосом в качестве средства доставки различных лекарственных препаратов в определенные органы и ткани. Наиболее интересные перспективы практического применения липосом связаны с химиотерапией, лечением диабета, артрита, лейшманиоза, а также введением РНК и ДНК в клетки для решения проблем генной инженерии и биотехнологии.

 

Ход работы. Отмерить в сухие пробирки спиртовые растворы полярных липидов:

а) 0,4 мл лецитина;

б) 0,2 мл лецитина + 0,2 мл холестерина.

Опустить в спиртовые растворы 1 – 2 стеклянных шарика и выпарить растворы на водяной бане, добавить к выпаренным липидам по 2 мл 50 mМ раствора калия хлорида и интенсивно встряхивать до получения молоковидной суспензии липосом.

Отмерить в 7 пробирок по 4,8 мл раствора калия хлорида в соответствии с данными таблицы. Добавить в каждую из пробирок по 0,2 мл суспензии липосом, тщательно встряхнуть и через 10 мин измерить оптическую плотность при 440 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве контроля используют 50 mМ раствора калия хлорида.

 

Оптическая плотность суспензий липосом в растворах калия хлорида различной концентрации.

Вариант

Липидный состав липосом

Оптическая плотность (D)

Осмотическая активность (tg a)

 

 

№ пробирки

1

2

3

4

5

6

7

 

Концентрация KCl, mМ

5

10

25

50

100

150

200

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Построить график зависимости оптической плотности суспензии липосом от концентрации растворов калия хлорида. Рассчитать осмотическую активность липосом, которая численно равна тангенсу угла наклона полученной прямой. Провести сравнительную оценку активности липосом липидного состава. Объяснить влияние холестерина на осмотическую активность липосом, приготовленных из цвиттер-ионных липидов.

 

Вариант 3: Получение микрокапсул липазы и пепсина методом диспергирования жидкость в жидкости в желатиновую и липидную оболочки.

Ход работы: 

  1. В котел наливают подсолнечное масло 250 мл и нагревают до 40 °С. 5 г желатина растворяют в 25 мл воды с предварительным набуханием и нагреванием. 2,5 г вещества смешивают с раствором теплого желатина. Полученную смесь тонкой струей подают в реактор с работающей мешалкой, от скорости вращения, которой зависит размер микрокапсул. Масло в реакторе охлаждают подачей в рубашку холодной воды. Микрокапсулы отделяют от масла процеживанием через капрон и промывают изопропиловым спиртом. Микрокапсулы сушат на воздухе 24 – 48 ч.
  2. В емкость наливают 50 мл 1 % раствора МЦ и нагревают до 35 °С. 5 г масла какао расплавляют до жидкого состояния, вносят 2,5 г включаемого в оболочку вещества, получают суспензию. Суспензию тонкой струей при вращении мешалки подают в емкость. Резко охлаждают жидкость, помещая ее на лёд. Получают дисперсию в вязкой среде. Полученная дисперсия может служить концентратом микрокапсул. Микрокапсулы также можно отделить, промывая микрокапсулы на сите холодной водой.

Литература:

  1. Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.
  2. Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.
  3. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. – М.: Агропромиздат. – 1990.
  4. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб.: ИФ Наук. – 1995.
  5. Иммобилизация ферментов и других биологически активных веществ. Учебн. пособие/ Сост. проф. Степанова, д.ф.н. Андреева И.Н., к.ф.н. Пантюхин А.В., Сысуев Б.Б. – Пятигорск: Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2001.
  6. Лекционный материал по биотехнологии.
  7. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987. – 410с.
  8. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. / Под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш. шк. – 1988. – 416с.
  9. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.
  10. Москвичев Б.В., Шуколюков С.А., Шучихина А.А. Проблемы и перспективы применения иммобилизованных ферментов и других биологически активных веществ в медицине: Центральное бюро научно-технической информации, 1983.
  11. Чуешов В.И. Промышленная технология лекарств: Учебник в 2-х т./ Под ред. Чуешова В.И. – Харьков: МТК-Книга; Издательства НФАУ. – 2002. – 716 с.

 Темы рефератов.

  1. Обзорная характеристика новых перспективных методы иммобилизации ферментов.
  2. Перспективные направления использования иммобилизованных ферментов.
  3. Перспективы иммобилизации целых клеток микроорганизмов и растений.
  4. Основные направления применения иммобилизованных клеток.
  5. Биокатализ в тонком органическом синтезе.
  6. Ферментные электроды на основе иммобилизованных ферментов.
  7. Биотехнологическое производство этилового спирта с применением иммобилизованных ферментов. 
  8. Современные перевязочные средства (с иммобилизованными антибиотиками, ферментами и другими биологически активными агентами).
  9. Кровезаменители, основные вещества природного и синтетического происхождения: современное состояние проблемы.
  10. Перспективы использования иммобилизованных ферментов в сфере трансформации стероидов.
  11. Возможности применения иммобилизованных ферментов в биокаталитическом получении простаноидов.

Приложение 1.

Примеры методов иммобилизации различных видов ферментов.

 

Адсорбция, или ионный обмен

Каталаза, Рибонуклеаза, a-Глюкозидаза, Пепсин, Трипсин, Аспарагиназа

Включение в гель

Лактатдегидрогеназа, Глюкооксидаза, Пероксидаза, Гексакиназа, Рибонуклеаза, Холинестераза, Щелочная фосфатаза, Кислая фосфотаза, a-Амилаза, Трипсин, Альдолаза

Поперечная «сшивка» с носителем

Лактатдегидрогеназа, Глюкооксидаза, Пероксидаза, Рибонуклеаза, Дезоксирибонуклеаза, Трипсин, Аденозинтрифосфатаза, Альдолаза

Прикрепление к носителю ковалентной связью (азидный метод)

Рибонуклеаза, Холинэстераза, Дезоксирибонуклеаза, Инвертаза, Трипсин, Аспарагиназа, Аденозинтрифосфатаза

Карбидный метод

Глюкозооксидаза, Пероксидаза, Рибонуклеаза, Щелочная фосфатаза, Дезоксирибонуклеаза, Трипсин

Бромциан-метод

Аспарагиназа, Ацетилхолинэстераза, Холинэстераза, Аспарагиназа

Метод диазотирования

Глюкооксидаза, Каталаза, Пероксидаза, Рибонуклеаза, Щелочная фосфатаза, a-Амилаза, Трипсин

Изотиоцианатный метод

a-Амилаза, Трипсин

  

Приложение 2. 

Примеры соиммобилизованных систем, включающих клетки в изолированные ферменты. 

Клетки

Ферменты

Процессы

Saccharomyces cerevisiae,

Lymomones mobilis

b-Глюкозидаза

Сбраживание целлюлозы до этилового спирта

Saccharomyces cerevisiae,

Lymomones mobilis

b-Галактозидаза

Сбраживание лактозы до этилового спирта

Saccharomyces cerevisiae

Глюкоамилазаза

Получение пива с низким содержанием декстринов

Saccharomyces cerevisiae

Пепсин

Получение вина с низким содержанием белков

Saccharomyces cerevisiae

Глюкозооксидаза

Превращение глюкозы в глюконовую кислоту

Aspergillus niger

Каталаза

Превращение глюкозы в глюконовую кислоту

Aspergillus niger

Глюкоамилаза

Удаление кислорода из пива



ИЛИ